近日，國際TOP期刊Science Advances在線發表了題為“Comparative analyses of bat genomes identify distinct evolution of immunity in Old World fruit bats”的研究論文。該研究由國內外多家單位研究人員共同協作完成。北京諾禾致源科技股份有限公司首席科學家、武漢大學田仕林博士和武漢大學曾嘉鳴為該論文的共同第一作者。

圖1 來自Science官網

(資料圖片僅供參考)

該研究提出了一種改良的四步法基因組組裝策略，完成了一個近乎完整的染色體級別的狐蝠科犬蝠屬犬蝠（Cynopterus sphinx）全基因組序列圖譜，并結合比較基因組學與細胞學實驗揭示了狐蝠科蝙蝠免疫基因演化的新機制，提示食果蝙蝠在應對病毒感染時可能有獨特的免疫機制。

蝙蝠已經演化出獨特的免疫系統來應對病毒感染，能夠無癥狀地攜帶多種哺乳動物烈性病毒，包括尼帕病毒、亨德拉病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、MERS病毒、SARS病毒以及最近引起COVID - 19的SARS - CoV - 2病毒，是這些人畜共患病毒的天然宿主。狐蝠科蝙蝠（舊大陸果蝠）被認為是引起國際公共衛生組織關注的多次病毒大流行事件中高致病性病毒的天然宿主。因此，研究狐蝠科蝙蝠免疫系統演化遺傳機制對人類制定病毒的防御和抗病毒治療策略具有重要的意義。

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研究結果

改良的四步法基因組組裝策略完成了犬蝠高質量參考基因組

該研究提出應用“先全局組裝，再聚類長讀長reads，接著局部組裝，后染色體掛載”的四步法改良基因組組裝策略，不同于當前常規的兩步法組裝流程（先組裝后染色體掛載）。該流程利用了染色質互作數據（Hi-C）預先對具有潛在連接關系的Nanopore長序列進行聚類，有效地去除了組裝過程中構建序列串圖（string graph）時的遠距離重復序列的嵌合連接。詳細步驟如下（圖2A）：

（1）組裝和糾正重疊群（Contigs）：基于高質量的三代測序數據，應用通用的構建序列串圖（string graph）組裝方法完成初始的Contig序列的組裝，然后利用基因組糾錯軟件來對初始Contig進行糾錯。從而得到了基因組序列Contig v1。

（2）通過Hi-C測序數據的互作頻率對Contig v1聚類：首先使用Bowtie2 軟件的單端模型將Hi-C測序數據映射到Contig v1上；接著，篩選出唯一的映射對后，使用 HiCUP流程過濾掉無效的自連接和未連接片段；然后，使用有效地互作reads使用凝聚層次聚類算法計算所有Contigs之間的鏈接頻率。最后，根據Contig之間的互作信號的密度大小判定聚類，并結合組裝物種的核型數據預設染色體連鎖群數目。通過上述操作，得到基因組的Contig連鎖群。

（3）對三代測序數據進行比對分類以執行連鎖群局部組裝：首先使用 Minimap2軟件將三代測序數據重新對齊到 Contig v1。在去除次優比對reads后，提取了每個連鎖群中最優比對的三代測序序列。接著，對每個連鎖群中比對的三代測序序列執行連鎖群局部組裝。與全局組裝相比，該策略可以有效地避免在組裝過程中構建string graph時，由于基因組遠距離重復序列引起的錯誤重疊關系。然后，評估每個連鎖群局部組裝的適當組裝參數，隨后進行基因組組裝和校正，方法與步驟（1）中提到的類似。最后，獲得了第二個基因組序列 Contig v2。

（4）將Contigs錨定到染色體上：利用ALLHiC軟件計算Contig v2中序列之間的互作頻率掛載基因組的染色體序列。隨后，將Hi-C互作頻率信息輸入到Juicebox軟件中進行可視化，再通過手動調整互作頻率表現出明顯離散的Contig之間的錯誤位置和方向。

圖2 改良的基因組組裝策略

應用上述的四步法改良基因組組裝策略（圖2），完成了一個近乎完整的染色體級別的狐蝠科（舊大陸果蝠）犬蝠屬犬蝠基因組序列圖譜。相比于傳統的兩步法，在基因組的連續性、完整性和準確性都表現出了優秀的性能。特別是，應用本文中的四步法組裝策略，完成了4條T2T級別的染色體序列。該方法還具有改良現有基因組組裝質量的潛力，比如，在本文中，應用四步法組裝策略，重新將已發表的庫氏伏翼蝠，（P . kuhli，論文比較基因組研究物種之一）的不完整X染色體組裝完全。

狐蝠科蝙蝠基因組進化

對11種蝙蝠（其中包括6種狐蝠科蝙蝠）和7種模式哺乳動物進行進化樹分析，發現蝙蝠陰翼手亞目和陽翼手亞目分化于65.5 MYA（圖3A）。之后分析了17個哺乳動物基因組與C . sphinx基因組的共線性，發現隨著與C . sphinx 進化距離的增加，共線性比率降低，并且狐蝠科內的物種之間具有更高水平的共線性。比較基因組分析發現C . sphinx與其他蝙蝠之間的大型染色體間重排事件（長度 ≥ 1Mb）主要發生在C . sphinx中最長的前12條染色體上，除了LG10（圖3B）。進一步分析發現C . sphinx LG10染色體序列與非蝙蝠哺乳動物的X染色體序列唯一匹配，平均共線性率為67.12 % （從小鼠的51.84 %到馬的74.05 %），因此推測LG10為C . sphinx的X染色體。值得注意的是，在所有蝙蝠的基因組中，除了P . kuhli外，都有一條染色體與C . sphinx的X染色體具有良好的共線性（從M. molossus的69.76 %到R . aegyptiacus的87.41 %）。推測已發表的P . kuhli X染色體序列被組裝成了多個獨立的Scaffold序列，因此，應用本論文中提出四步法組裝策略重新組裝了一條完整的P . kuhlii X染色體序列。總之，研究結果表明了蝙蝠的X染色體與其他哺乳動物一樣，是高度保守的（圖3）。

圖3 進化樹和基因組共線性分析

論文中還以狐蝠科染色體級別的基因組C . sphinx和R . aegyptiacus為代表，進行了特異性序列鑒定和分析，結果發現狐蝠科基因組中攜帶內源性逆轉錄病毒元件片段。這些內源性逆轉錄病毒大多數屬于γ逆轉錄病毒，其次是β逆轉錄病毒。對每個逆轉錄病毒基因的5 和3 長末端重復序列（long terminal repeat，LTR）進行預測并估計它們在逆轉錄病毒感染時的分歧率。結果發現這兩個狐蝠科都經歷了兩個古老的逆轉錄病毒整合爆發事件，一個在1 - 3 Mya左右，另一個在10 - 12 Mya左右。由于蝙蝠比大多數其他哺乳動物更耐受病毒感染，因此推測更頻繁的病毒基因整合到宿主基因組中可能是狐蝠科基因組多樣性的重要因素之一。

狐蝠科基因家族進化

基因組片段復制（Segmental duplications，SDs）是基因組大片段（> 1 kb）和高一致性（> 90 %序列一致性）區域拷貝數倍增事件，對基因組中的基因創新具有重要意義。因為SD序列具有高重復性，往往對于基因組組裝帶來高難度挑戰。因此，該研究只對于7種染色體級別的蝙蝠基因組進行了SD分析，平均鑒定了34.38 Mb的SDs，含有611個基因。論文在兩只狐蝠科蝙蝠（C. sphinx和R . aegyptiacus）的特有SD區域鑒定到24個人類同源基因，其中20個至少在一個狐蝠科基因組中發生了基因復制。其中包括一個肽聚糖識別蛋白（peptidoglycan recognition protein，PGRP）家族成員PGLYRP1，該位點在哺乳動物中一般是單拷貝形式，其蛋白產物由活化的中性粒細胞釋放，通過與肽聚糖結合識別感染的微生物，發揮抑菌和殺菌活性。因此，推測狐蝠科蝙蝠中該基因拷貝數變異有助于減輕其炎癥反應。

為進一步解析狐蝠科中基因家族的進化關系，將鑒定到的基因家族分為核心（跨所有物種共享）的基因家族（67.68%），部分共享的基因家族（25.58%）和物種特異性的基因家族（6.75%）（圖4A）。對狐蝠科擴張和收縮的基因家族進行分析，共鑒定到14個擴張的基因家族和11個收縮的基因家族。有趣的是，大多數擴張的基因家族中至少有一個位于C . sphinx和R . aegyptiacus基因組的SD區域內，再次表明SDs可能與基因組中的基因創新有關。

論文在狐蝠科收縮的基因集中，發現NLR基因（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat）家族中的關鍵炎癥小體NLRP1基因在所有狐蝠科蝙蝠中缺失（圖4B）。NLRP1是第一個被證明可形成炎癥小體的蛋白。通過比較蝙蝠中NLRP1（或其推斷的刪除位點）上下游同源的重復序列類型LINE - 1（L1）插入情況，發現狐蝠科中L1插入數量和累積長度均較低。因此，推測L1插入介導NLRP1基因序列的缺失，從而導致相關炎癥反應的減弱。在狐蝠科蝙蝠擴張的基因家族中，發現了C5AR2基因序列的串聯重復（圖4C）。C5AR2是補體過敏毒素C5a的受體，具有調節TLR4介導的NLRP3炎癥小體活化和巨噬細胞IL1 β釋放的抗炎功能。與5個非狐蝠科蝙蝠中發現的C5AR2單拷貝不同，在狐蝠科中發現了2個拷貝，并且位于基因組SD區域。論文推測C5AR2基因的串聯重復可能增強了狐蝠科巨噬細胞IL1 β釋放的能力，從而抑制病毒感染后的炎癥反應。

圖4 基因家族進化分析

狐蝠科蝙蝠免疫基因進化

通過對狐蝠科的祖先分支應用PAML中的分支測試和分支位點測試，分別鑒定到316個快速進化基因（REGs）和241個正選擇基因（PSGs）。在這些基因中，分別有35個REGs （11 %）和46個PSGs （19 %）在免疫和/或抗病毒反應中發揮作用。而對REGs和PSGs富集分析發現狐蝠科進化出了不同的適應機制來對抗病毒感染，包括模式識別和干擾素（IFN）介導病毒復制（圖5A）。研究還發現了狐蝠科正選擇基因IGF2F（胰島素樣生長因子2受體）在宿主防御的第一道防線中發揮作用；狐蝠科正選擇基因MEFV作為自噬受體降解多個炎性小體成分（如NLRP3），為之前證明的蝙蝠NLRP3炎性小體活化水平低提供了新的證據；狐蝠科正選擇基因環狀GMP-AMP合成酶基因cGAS的N端和C端序列的特異性分子改變分別表現出增強對病毒DNA感知和減弱病毒炎癥反應的不同免疫功能。

論文還通過同源比對搜索了KOBAS 3.0數據庫中與免疫系統過程和病毒過程相關的直系同源基因，一共鑒定了2,162個免疫相關的直系同源基因集。利用PAML軟件包的one-ratio模型（model 0）證明了狐蝠科蝙蝠的平均ω值顯著地高于其它蝙蝠和非蝙蝠哺乳動物（圖5B）。還通過比較模型M8a（ω = 1）與模型M8（ω > 1）對每個免疫基因進行正選擇位點模型測試，發現狐蝠科蝙蝠的正選擇基因數目也極顯著多于其它蝙蝠和非蝙蝠哺乳動物（圖5C）。因此，論文得出了狐蝠科蝙蝠在免疫相關基因中表現出比其它蝙蝠和非蝙蝠哺乳動物更高的分子適應率。

圖5 狐蝠科特異性的免疫基因分子適應機制

MyD88突變抑制狐蝠科蝙蝠中TLR2依賴的炎癥反應

盡管越來越多的研究報道了蝙蝠潛在的免疫分子適應機制，但很少有實驗驗證蝙蝠特異性變異對表型的影響。論文對上述2,162個直系同源基因進行分析，鑒定出628個基因蛋白中至少有1個氨基酸在狐蝠科蝙蝠和其他蝙蝠之間存在理化性質差異，并發現這些基因的平均ω值顯著高于其他1,534個免疫基因。進一步的從中篩選受到正選擇/快速進化的基因，并鑒定到了快速進化基因TLR2和MyD88。它們是TLR-MyD88信號傳導通路中的重要分子。特別是，研究發現了狐蝠科蝙蝠相對于人類的4個特異性氨基酸突變殘基屬于TLR2-MyD88復合物中MyD88蛋白與TLR2蛋白的關鍵分子接口（P169、S170、A208和Q237），并且這4個氨基酸突變都導致MyD88蛋白的理化性質改變。

最后，論文針對狐蝠科MyD88的4個特異性突變設計了細胞分子實驗（圖6）。首先，通過在狐蝠Paki細胞進行免疫共沉淀（Co-IP）實驗，證實了MyD88蛋白的特異性突變降低了其與Toll樣受體TLR2的結合親和力。接著，還分別在黑妖狐蝠Paki細胞和人類PEAKrapid細胞中進行了過表達實驗，證明了MyD88蛋白的特異性突變減弱其對TLR2依賴性炎癥因子的誘導。總之，這些結果揭示了蝙蝠在應對病毒感染時，具有系統性的免疫反應下調。

圖6 狐蝠科蝙蝠MyD88特異性突變抑制炎癥反應的分子實驗證據